蝦青素對(duì)D-半乳糖老齡大鼠骨質(zhì)影響
作者：裴凌鵬，董福慧，惠伯棣
作者單位：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院骨傷科研究所，北京 100700； 北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院
【摘要】 目的 研究ASTA蝦青素對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠骨質(zhì)的影響。方法 用D-半乳糖注射Wistar雄性大鼠5個(gè)月，建立衰老模型，測(cè)定青年對(duì)照組、致衰老模型組、蝦青素組和正常老齡對(duì)照組骨常規(guī)參數(shù)并進(jìn)行比較分析。結(jié)果致衰老模型組骨密度、骨結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)、生物力學(xué)參數(shù)、骨鈣、鎂、錳及羥脯氨酸含量與青年對(duì)照組比較有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)；而骨磷含量、骨和血清堿性磷酸轉(zhuǎn)移酶與青年對(duì)照組比較有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)；這些變化與正常老齡對(duì)照組的變化趨勢(shì)一致，并比后者變化得更顯著。相比之下，蝦青素組在上述參數(shù)指標(biāo)與致衰老模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)。結(jié)論 長(zhǎng)期大量攝入D-半乳糖導(dǎo)致大鼠衰老同時(shí)可能誘發(fā)其發(fā)生骨質(zhì)變化，而蝦青素可以預(yù)防或降低此類致衰老骨質(zhì)變化的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松,骨密度,羥脯氨酸,蝦青素
D-半乳糖衰老機(jī)制是指在一定時(shí)間內(nèi)，給動(dòng)物連續(xù)注射大劑量的D-半乳糖，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高。在醛糖還原酶的催化下，還原成半乳糖，該物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞的正常生理代謝，導(dǎo)致機(jī)體衰老。衰老過(guò)程常會(huì)伴隨著老年性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，因此，利用致衰老模型探索致老年性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制具有一定的研究?jī)r(jià)值。蝦青素是一種非維生素A原的羥酮式類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界的海洋動(dòng)物體、藻體及少數(shù)陸生植物體內(nèi)并具有多種生物學(xué)功能，其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用明顯。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)ASTA蝦青素對(duì)骨質(zhì)常參數(shù)如骨密度、骨結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)、生物力學(xué)參數(shù)、主要骨礦物質(zhì)(鈣、鎂、錳、磷)、血清磷鈣、羥脯氨酸含量及堿性磷酸酶活性等來(lái)研究此類化合物對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠骨質(zhì)的影響。
1 材料與方法
11 主要儀器和試劑 Labconco冰凍真空干燥儀(法國(guó)樂(lè)高公司)；752分光光度計(jì)、AE100電子天平(中國(guó)伯樂(lè)公司)；電熱三用水箱、KA-1000型臺(tái)式離心機(jī)(中國(guó)杭州華亭公司)；960型熒光分光光度計(jì)、J2-SH高速冰凍離心機(jī)、Lunar-XR型雙能X線骨密度測(cè)定儀、島津萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)、火焰原子吸收分光光度計(jì)(日本島津公司)；C30柱(YMC Carotenoid S-5,Waters)高效液相色譜(HPLC)(Waters 600E溶劑輸送系統(tǒng)，PDA-2996二極管陣列檢測(cè)器Waters),丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定度劑盒(南京建成生物工程研究所)；蝦青素乳化劑(瑞士羅氏公司)；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)(美國(guó)迪馬公司)；無(wú)水乙醇(北京化學(xué)試劑公司)；大孔吸附樹脂(天津農(nóng)業(yè)股份公司)。
12 乳化劑破乳制備蝦青素
121 蝦青素萃取 稱取10g乳化顆粒，加入300ml丙酮-正己烷萃取。將脂溶性相收集，再進(jìn)行濃縮處理。
122 蝦青素提取液柱色譜純化 (1)裝柱：將活化好的氧化鋁裝填于玻璃層析柱中，用正己烷潤(rùn)濕。(2)洗脫：分別取2ml蝦青素提取液上柱，用50ml正己烷-丙酮淋洗，收集洗脫液。將洗脫液用氮?dú)獯蹈芍品蹅溆谩?span lang="EN-US">
13 蝦青素鑒定 根據(jù)其高效液相色譜(HPLC)中保留時(shí)間和紫外可見(jiàn)吸收光譜的特征峰與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照進(jìn)行鑒定。
14 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
141 D-半乳糖致衰老動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥模型的建立 6周齡Wistar雄性大鼠45只隨機(jī)分為3組，即致衰老模型組、青年對(duì)照組和蝦青素組，每組15只，另購(gòu)16月齡同品系大鼠15只作為正常老齡對(duì)照組。致衰老模型組和蝦青素組每天用15g/(kg·bw)的D-半乳糖頸背部皮下注射，劑量為01ml/10g，其中蝦青素組每天每只以02ml灌喂20mg/(kg·bw)，所用蝦青素由本實(shí)驗(yàn)室提供。青年對(duì)照組注射等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)注射5個(gè)月，自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量鼠的體重并取各組大鼠，稱重后乙醚麻醉，暴露腹部，下腔靜脈取血，待測(cè)血清中MDA含量、血清鈣、血清磷、血清堿性磷酸酶(ALP)，血中SOD活性；分離各組大鼠的雙側(cè)股骨，測(cè)定骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨密度、骨結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)指標(biāo)；骨中鈣、磷、錳、鎂、羥脯氨酸含量和骨中ALP活性。
142 生化指標(biāo)測(cè)定 MDA含量測(cè)定硫代巴比妥酸(TBA)比色法；SOD活性測(cè)定采用亞硝酸鹽法。
143 其他測(cè)定指標(biāo) 血清ALP活性采用氨基氨替比啉測(cè)酚法測(cè)定；血清鈣用乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法；血清磷采用孔雀綠微量比色法；骨中ALP采用化學(xué)免疫法試劑盒測(cè)定(中國(guó)科學(xué)院生物物理所中生公司)。
144 股骨骨密度測(cè)定 取股骨解凍后置于骨密度測(cè)定儀上，分近段、骨中段、遠(yuǎn)段3部分測(cè)其骨密度。近段和遠(yuǎn)段代表松質(zhì)骨骨密度，骨中段代表皮質(zhì)骨骨密度。測(cè)定參數(shù)：掃描寬度20nm，掃描速度7mm/s。
145 骨結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)的測(cè)定 取大鼠左股骨，用千分尺測(cè)量右側(cè)股骨的長(zhǎng)度；用分析天平稱量?jī)蓚?cè)股骨的重量；將股骨標(biāo)本進(jìn)行3點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，得到載荷-撓度曲線。由此曲線可直接得出大鼠骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)(最大載荷、最大撓度、彈性載荷、彈性撓度)。測(cè)定參數(shù)為：下壓速度10mm/min;下壓幅度4mm；保持時(shí)間5s；跨度22mm。斷骨后，取股骨中部作徑向切片，在顯微鏡下用顯微盡測(cè)量股骨的最大外徑A、最小外徑B、最大內(nèi)徑a、最小內(nèi)徑b。并計(jì)算出大鼠股骨的各項(xiàng)生物力學(xué)指標(biāo)。
146 骨中鈣、錳、鎂的含量 取大鼠右側(cè)股骨近端稱重，研碎。然后進(jìn)行灰化2h。取出骨灰，硝酸溶解。經(jīng)處理后，火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鈣、錳、鎂的含量。
147 骨中磷的含量 取大鼠右側(cè)股骨近端稱重，研碎。然后進(jìn)行灰化2h。取出骨灰，硫酸溶解。經(jīng)處理后，用鉬藍(lán)顯色定磷法于660nm波長(zhǎng)下測(cè)定。
148 骨中羥脯氨酸的含量 取大鼠右側(cè)股骨上端稱重，研碎。用3ml氯仿-甲醇處理2h，過(guò)濾。再用乙醇水和丙酮沖洗1次，放入烤箱2h。取出后放入1ml 12mol/l的HCl水解2h，取出后處理用氯胺T法于560nm波長(zhǎng)下測(cè)定。
15 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS110統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行齊性檢驗(yàn)并作方差分析。
2 結(jié)果
21 蝦青素提取與鑒定 有機(jī)試劑的反復(fù)提取后，通過(guò)柱層析洗脫后可以得到高純度的蝦青素提取物，經(jīng)HPLC及其光譜特征峰鑒定為反式蝦青素單體。
22 D-半乳糖大鼠衰老模型建立 與青年對(duì)照相比，致衰老模型組血清MDA含量升高，而血液SOD活性均有所降低，與正常老齡對(duì)照組變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明D-半乳糖大鼠衰老模型建立成功。而蝦青素組與致衰老模型組比較，血清MDA含量升高，血液SOD活性降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)。
表1 血清MDA含量和血液SOD活性（略）
注：各組與青年對(duì)照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<001
23 股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)、生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定 與青年對(duì)照組比較，正常老齡對(duì)照組在股骨重量、長(zhǎng)度明顯增加，而致衰老模型組2項(xiàng)指標(biāo)明顯減少。而在股骨密度、結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)指標(biāo)方面表明，正常老齡對(duì)照組和致衰老模型組與青年對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<005)。正常情況下隨年齡的增長(zhǎng)，大鼠股骨長(zhǎng)度和重量都會(huì)相應(yīng)增加，同時(shí)由于各種內(nèi)外因素其股骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)將呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射D-半乳糖5個(gè)月可以達(dá)到改變股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)的指標(biāo)，且作用與正常老齡大鼠變化趨勢(shì)一致，證明在建立D-半乳糖致衰老模型的同時(shí)，也可以導(dǎo)致老年性骨質(zhì)疏松癥的可能。而蝦青素組與致衰老模型組比較，骨密度、結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)參數(shù)指標(biāo)均有所升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<005)。
表2 股骨結(jié)構(gòu)力學(xué)、生物力學(xué)指標(biāo)（略）
注：各組與青年對(duì)照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<005,d P<001
24 骨礦物質(zhì)含量、血鈣磷及ALP活性 與青年對(duì)照組比較，致衰老模型組和正常老齡對(duì)照組骨鈣、錳、鎂及血磷含量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)，表明注射D-半乳糖的大鼠骨中幾種重要的礦物質(zhì)含量比同齡正常大鼠有所降低，而與正常老齡對(duì)照組的骨礦物質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致。再次證明長(zhǎng)期服用D-半乳糖可以導(dǎo)致老年性骨質(zhì)疏松癥的可能。而蝦青素組與致衰老模型組相比，骨鈣、錳、鮮及血磷含量均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)。與青年對(duì)照組比較，致衰老模型組和正常老齡對(duì)照組骨中羥脯氨酸含量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)。致衰老模型組血清ALP和骨ALP活性與青年對(duì)照組比較顯著升高；致衰老模型組與正常老齡對(duì)照組血清ALP活性比較也有所升高，2組變化趨勢(shì)一致。而蝦青素組與致衰老模型組比較，羥脯氨酸含量明顯升高，血清ALP和骨ALP活性較明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)。
表3 骨礦物質(zhì)含量、血鈣磷及ALP活性測(cè)定（略）
注：各級(jí)與青年對(duì)照組比較，a P<005，b P<001；與致衰老模型組比較，c P<001,d P<001
3 討論
研究表明，大量的活性氧攝入會(huì)從整體、細(xì)胞和基因不同水平層次上影響骨的代謝過(guò)程。當(dāng)大量進(jìn)食D-半乳糖會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的自由基，在骨重建中，自由基可以破壞膠原蛋白形成，導(dǎo)致骨中礦物質(zhì)沉積減少，從而造成鈣、磷、鎂、錳等元素的流失，影響骨密度，抑制骨的形成，造成老年骨質(zhì)疏松。同時(shí)膠原蛋白加速分解生成羥脯氨酸并隨血、尿流失，且隨年齡而增加，使得骨中兩者的含量均相應(yīng)減少。另外由于骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)建成受阻，同時(shí)礦物質(zhì)含量下降，從而使骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)受到了影響，大大降低了骨的抗變性能力，提高了發(fā)生骨折的機(jī)率。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素可以有效地緩解增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)對(duì)局部細(xì)胞因子(如ALP酶、Ⅰ型膠原蛋白等)具有上調(diào)作用，表明蝦青素可能參與骨代謝有關(guān)調(diào)節(jié)活動(dòng)，再加上其極強(qiáng)的抗氧化能力，或許對(duì)致衰老性骨質(zhì)疏松癥具有一定預(yù)防或輔助治療意義。本實(shí)驗(yàn)中青年對(duì)照組血清ALP活性低于致衰老模型組和正常老齡對(duì)照組，而致衰老模型組又高于正常老齡對(duì)照組，這可能是由于晚期糖化終末產(chǎn)物(AGEs)濃度增加，使破骨過(guò)程顯著增強(qiáng)，成骨過(guò)程繼發(fā)增加，骨代謝處于一種高轉(zhuǎn)變狀態(tài)，成骨細(xì)胞的活躍造成血ALP活性增加。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)有關(guān)骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)指標(biāo)檢驗(yàn)，證實(shí)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠過(guò)程的同時(shí)，可能誘發(fā)致衰老性骨質(zhì)疏松。而ASTA蝦青素可有效地緩解此類致衰老性骨質(zhì)變化。
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蝦青素對(duì)D-半乳糖老齡大鼠骨質(zhì)影響
